Bottenlaget Almeria vann på hemmaplan med 1–0 och tog tidernas första seger mot storklubben.
För Barcelona var det blott den andra förlusten i ligan den här säsongen och lagets 13 matcher långa förlustfria svit bröts.
Barcelona leder fortfarande La Liga med sju poängs marginal till tvåan Real Madrid, men laget missade chansen att rycka till sig en näst intill ointaglig ledning i jakten på sin första ligatitel sedan 2019. Real kryssade, 1–1, i derbyt mot Atletico Madrid i lördags trots spel med en man mer sista halvtimmen.
För Barcelona var förlusten den andra stora smällen på några dagar då Xavi Hernandez lag åkte ur Europa League tidigare i veckan mot Manchester United.
El Bilal Touré sköt segermålet efter 24 minuters spel. Segern innebär att Almeira lämnade platsen som nästjumbo och klev över nedflyttningsstrecket.
Barcelona möter på torsdag Real Madrid i den första semifinalen i Copa del Rey på Santiago Bernabeu.